Образование симбиотических клубеньков на корнях гороха

Азот - существеннейший фактор почвенного плодородия. Он входит в состав жизненно важных соединений - аминокислот, белков, нуклеиновых кислот.

Атмосфера Земли содержит колоссальное количество азота - 79,2 процента, однако он недоступен для растений. Для растений важен не атмосферный азот, а содержащийся в почве. Между тем запасы доступных для растений форм азота даже в черноземных почвах не так велики, чтобы бесперебойно обеспечивать высокие урожаи сельскохозяйственных культур.

В почве азот находится в связанном состоянии в основном в виде солей азотной кислоты (нитратов) и солей аммония. Еще в XVII веке немецкий химик Иоганн Глаубер (1604—1670) обратил внимание на исключительную важность этих соединений для роста растений. В своих сочинениях он назвал селитру солью плодородия. Началась интенсивная эксплуатация залежей чилийской селитры. Человечество освоило искусственную фиксацию атмосферного азота, создало мощную азотную индустрию.

Однако огромные масштабы промышленного производства связанного азота вселяют в нас не только уверенность в устойчивых высоких урожаях, но и обоснованную тревогу в связи с загрязненностью природной среды азотистыми соединениями. Чрезмерное внесение в почву азотных удобрений нарушает естественный круговорот веществ. К тому же растения усваивают только 40-50 процентов внесенного в почву азота, а остатки попадают в водоемы и грунтовые воды, вызывая их загрязнение. Нитраты и нитриты чрезвычайно опасны для здоровья людей.

В связи с остротой нитратной проблемы ученые еще настойчивее изучают процессы естественной фиксации атмосферного азота клубеньковыми бактериями, а также некоторыми свободноживущими микроорганизмами.

Именно благодаря этим микроорганизмам содержание азота в почвах в случае их рационального использования сохраняется или даже несколько увеличивается. На каждом гектаре почв, занятом бобовыми растениями, имеющими на корнях клубеньки, фиксируется от 100 до 250 килограммов атмосферного азота. Часть его используется самими бобовыми для синтеза азотсодержащих веществ (аминокислот, белков, нуклеиновых кислот. ), а около 30 процентов остается с пожнивными остатками в почве, обеспечивая тем самым повышение ее плодородия.

Из всех живых организмов только бактерии нескольких родов способны к фиксации атмосферного азота. Наиболее известная из них - это симбиотическая бактерия Rhizobium, которая образует клубеньки на корнях бобовых и некоторых других растений.

В 1866 г. известный ботаник и почвовед М. С. Воронин увидел в клубеньках на корнях бобовых растений мельчайшие «тельца». Воронин выдвинул смелые для того времени предположения: он связал образование клубеньков с деятельностью бактерий, а усиленное деление клеток ткани корня с реакцией растения на проникшие в корень бактерии. Двадцать лет спустя голландский ученый Бейеринк выделил из клубеньков гороха, вики, чины, фасоли, сераделлы и лядвенца бактерии и изучал их свойства, проверив способность заражать растения и вызывать образование клубеньков.

Клубеньковые бактерии могут быть палочковидными и овальными. Из 13000 видов (550 родов) бобовых растений наличие клубеньков выявлено пока только приблизительно у 1300 видов (243 рода). Сюда в первую очередь относятся виды растений, использующиеся в сельском хозяйстве (более 200).

Клубеньковые бактерии снабжают бобовое растение азотом, который фиксируют из воздуха. Растения же, в свою очередь, поставляют бактериям продукты углеводного обмена и минеральные соли, необходимые им для роста и развития.

Таким образом, бобовые растения и клубеньковые бактерии находятся в состоянии симбиоза.

Клубеньковые бактерии микроаэрофилы (развиваются при незначительных количествах кислорода в среде), предпочитающие, однако, аэробные условия (аэробы). Если говорить о клубеньковых бактериях вообще, то для них образование клубеньков только у группы бобовых растений уже само по себе специфично - они обладают избирательностью к бобовым растениям. Среди них есть такие, которые способны заражать лишь определенную, иногда большую, иногда меньшую, группу бобовых растений.

Специфичность клубеньковых бактерий может быть узкой (клубеньковые бактерии клевера заражают только группу клеверов). При широкой специфичности клубеньковые бактерии гороха могут заражать растения гороха, чины, бобов, а клубеньковые бактерии чины и бобов могут заражать растения гороха, т. е. все они характеризуются способностью «перекрестного заражения».

В связи с вышеизложенным, нам показалось интересным проследить процесс образования симбиотических клубеньков на корнях гороха Pisum sativum.

Цели и задачи исследования:

1. Изучить литературу по теме исследования.

2. Разработать методику проведения эксперимента.

3. Выяснить, на каком этапе развития растения гороха Pisum sativum на его корнях появляются видимые симбиотические клубеньки.

4. Сделать наглядные пособия для уроков биологии.

Новизна работы в том, что нами была придумана и опробована методика наблюдений за образованием клубеньков на корнях гороха. Прикладное значение работы в том, что приготовленные препараты корней гороха с клубеньками используются как демонстративный материал на уроках ботаники.

Основная часть

2. 1. Методика проведения эксперимента

В качестве объекта исследования выбрано растение гороха Pisum sativum сортов «Орегон» и «Альпийский изумруд».

Жизненная форма гороха – однолетняя трава, что позволяет за сравнительно короткий срок (2 месяца) получить результаты эксперимента.

Для исключения влияния неблагоприятных условий, главным образом погодных, в период вегетации растения, семена желательно сеять в закрытом грунте (в теплице, на подоконнике или лоджии). Можно использовать один большой или несколько маленьких контейнеров, заполненных одинаковой земляной смесью.

В качестве субстрата для выращивания растений можно взять обычную почву с садового участка, либо готовый грунт из садового центра.

Семена перед посевом замочить в воде. Проклюнувшиеся семена посадить в грунт, полить. Через каждые 2 дня после появления проростков извлекать по одному растению, освобождать корни от частиц почвы, промывая водой.

Необходимо внимательно осматривать корни растений и фиксировать все изменения, происходящие в процессе выращивания гороха.

2. 2. Ход эксперимента. Результаты и обсуждения

Этап № 1. Подготовка семян к посеву.

1 июля я взяла семена гороха сорта «Орегон» и положила их под марлю. Я залила их водой так, чтобы вода почти полностью покрыла семена, но в то же время они могли дышать. Они были зеленого цвета.

В магазинах города продается не только сорт «Орегон». Я также купила и «Альпийский изумруд», который, для сравнения, положила в другое блюдце. Хоть и называется этот сорт «Альпийский изумруд», цвет его семян желтый. Вероятно, название он получил из-за изумрудного цвета семян, находящихся в состоянии молочной спелости. Семена крупнее семян сорта «Орегон».

В одном пакетике примерно по 15 семян. Всего пакетиков я взяла четыре штуки, каждого вида по два пакетика. Так много семян потребовалось на случай того, что не все семена прорастут.

Сухие семена жесткие и сморщенные. К вечеру семена гороха набухли, стали мягкими, то есть из состояния покоя они перешли в стадию набухания.

Этап № 2. Наблюдение за прорастанием семян.

6 июля, через 5 суток после начала эксперимента, семена стали крупнее, семенная кожура стала гладкой. Воду я меняла чаще, чтобы выделялись вещества – тормозители прорастания. Проростков еще не видно. В цвете семян преобладает зеленый пигмент. На улице было жарко, t=27oC и на подоконнике температура воздуха была высокая, что способствовало прорастанию семян. Ведь, как известно, для прорастания семян необходимы вода, воздух и оптимальная температура.

7 июля семена сорта «Орегон» стали в два раза крупнее. Семена сорта «Альпийский изумруд» постепенно становятся ярче и крупнее. Их размер в полтора раза больше, чем накануне.

По литературным данным время от посева до появления ростков может достигать трех недель.

На поверхности семян появились светлые вздутия – начало фазы наклевывания, но они появились не у всех семян.

У сорта «Орегон» они образовались у половины семян (50% всхожести).

У сорта «Альпийский изумруд» светлые вздутия больше по размеру, но у меньшего количества семян (30% всхожести).

Воду семена поглощают хорошо. Если на ночь поменять воду, утром следующего нужно было добавлять снова, несмотря на прохладную температуру ночью около 18 oC.

Фаза наклевывания произошла раньше, чем описывалось в прочитанной мной литературе – через неделю после намачивания семян.

8 июля у семян появились корешки, они белые, светлые. У сорта «Альпийский изумруд» они крупнее, чем у сорта «Орегон». Это объясняется тем, что семена «Альпийского изумруда» крупнее, следовательно содержат больше запасных питательных веществ.

Этап № 3. Посадка семян гороха в почву.

10 июля. Сегодня я посадила семена гороха в почву «Terra Vita». Фаза наклевывания наступила у обоих сортов на 10-е сутки.

Всего я посадила 17 семян, из которых 5 сорта «Альпийский изумруд» и 12 сорта «Орегон».

Сначала я в каждый горшок насыпала почву (потребовалось 2 пакета земли), сделала ямку в каждом горшке и положила в каждую ямку по семени вниз корешком.

Засыпала семя почвой и побрызгала водой, чтобы увлажнить ее.

Длина корешков проростков составила примерно 4мм. Нужно сажать их осторожно, чтобы они не сломались.

Через 5 дней из почвы появились проростки.

Максимальная высота растений – 2,5 см.

Минимальная высота растений – 0,5 см.

Оба сорта развиваются примерно одинакого, но все же заметно опережение в развитии у сорта «Альпийский изумруд».

Через 2 недели после посева высота растений доходит до 10 см. Появились первые настоящие листья с усиками.

Стержневая корневая система растения имеет много боковых корней. На этой стадии нет видимых изменений корневой системы, связанных с проникновением бактерий.

Согласно литературным данным бактерии рода Risobium начинают проникать в корни бобовых уже на стадии проростка.

О механизме проникновения клубеньковых бактерий в корень растения существует ряд гипотез.

Авторы одной из гипотез утверждают, что клубеньковые бактерии проникают в корень через повреждения эпидермальной и коровой ткани (особенно в местах ответвления боковых корней).

Интересна и не лишена оснований гипотеза о проникновении клубеньковых бактерий в ткань корня через корневые волоски, её признает большинство исследователей.

Не исключено, что клубеньковые бактерии могут проникать в корень через эпидермальные клетки молодых верхушек корня. По мнению

Пражмовского (1889), бактерии могут проникать в корень только через молодую клеточную оболочку (корневых волосков или эпидермальных клеток) и совершенно не способны преодолевать химически измененный или опробковевший слой коры. Этим можно объяснить, что клубеньки обычно развиваются на молодых участках главного корня и появляющихся боковых корнях.

Известно, что клубеньковые бактерии вызывают размягчение стенок корневых волосков. Однако ни целлюлазы, ни пектинолитических ферментов они не образуют. В связи с этим было высказано предположение, что клубеньковые бактерии проникают в корень благодаря выделению ими слизи полисахаридной природы, вызывающей синтез растениями фермента полигалактуроназы. Этот фермент, разрушая пектиновые вещества, влияет на оболочку корневых волосков, делая её более пластичной и проницаемой. [1]

Процесс внедрения клубеньковых бактерий в ткань корня одинаков у всех видов бобовых растений и состоит из двух фаз. В первую фазу происходит инфицирование корневых волосков. Во вторую фазу интенсивно идет процесс образования клубеньков. Продолжительность фаз различна у разных видов растений: у Trifolium fragiferum первая фаза продолжается 6 дней, у Trifolium nigrescens – 3 дня. В некоторых случаях очень трудно обнаружить границы между фазами. Наиболее интенсивное внедрение клубеньковых бактерий в корневые волоски происходит на ранних этапах развития растения. Вторая фаза заканчивается в период массового образования клубеньков.

Для того чтобы не пропустить начала второй фазы – образования видимых клубеньков, нам необходимо было каждые два дня извлекать из почвы по одному растению, внимательно рассматривать корни и фиксировать изменения. На фото №2 – появление проростка и фото №3 – образование первых настоящих листьев. В этот период не было обнаружено клубеньков. На фото №4 длина стебля 15 см, длина корней 15 см. Видимых изменений на корнях не обнаружено. На фото №5 длина корня не изменилась, но появились новые боковые корни. Длина стебля более 20 см, появился первый цветок.

На фото №6 длина корня 25 см. На боковых корнях после промывания их водой хорошо видны вздутия – клубеньки.

Проникнув в корень (через корневой волосок, эпидермальную клетку, места повреждений корня), клубеньковые бактерии далее перемещаются в ткани корня растения. Наиболее легко бактерии проходят через межклеточные пространства.

Однако в большинстве случаев внедрившаяся клетка, активно размножаясь, образует так называемые инфекционные нити (или инфекционные тяжи) и уже в виде таких нитей перемещается в ткани растения.

По существу инфекционная нить – это колония размножившихся бактерий. У однолетних растений инфекционные нити возникают обычно в первый период инфицирования корня, у многолетних – в течение длительного периода развития.

Бактерии могут высвобождаться из инфекционной нити в разное время и разными способами.

Сосудистая система клубенька обеспечивает связь между бактериями и растением – хозяином. По сосудистым пучкам транспортируется питательные вещества и продукты обмена.

Клубеньковые бактерии, вышедшие из инфекционной нити, продолжают размножаться в ткани хозяина. Основная масса бактерий размножается в цитоплазме клетки, а не в инфекционной нити. Зараженные клетки дают начало будущей бактероидной ткани.

Наполняющиеся быстро размножающимися клетками клубеньковых бактерий растительные клетки начинают усиленно делиться. После того как растительные клетки полностью заполнятся бактериями, митоз прекращается. Однако клетки продолжают увеличиваться в размере и часто сильно вытягиваются, что приводит к образованию опухолеподобных клубеньков. Бактероидная зона клубенька занимает его центральную часть и составляет от 16 до 50 % от общей сухой массы клубеньков.

При выращивании гороха необходимо было создавать условия, без которых невозможно образование ими клубеньков. Одним из важнейших является достаточный полив.

Для развития клубеньков оптимальная влажность 60 – 70% от полной влагоемкости почвы. Минимальная влажность почвы, при которой еще возможно развитие клубеньковых бактерий в почве, приблизительно равна 16% от полной влагоемкости. При влажности ниже этого придела клубеньковые бактерии обычно уже не размножаются, но тем не менее они не погибают и могут длительное время сохраняться в неактивном состоянии. Недостаток влаги приводит и к отмиранию уже сформировавшихся клубеньков.

Так как почвенный субстрат “Terra Vita” не обладает достаточной влагоемкостью, поливать приходилось часто по мере высыхания почвы.

Избыточная влажность, как и ее недостаток, также не благоприятна для симбиоза – из-за снижения степени аэрации в зоне корней ухудшается снабжение корневой системы растения кислородом. Недостаточная аэрация отрицательно влияет и на живущие в почве клубеньковые бактерии, которые, как известно, лучше размножаются при доступе кислорода.

С помощью лакмусовой бумаги нами проверялась почва, в которой выращивался горох, так как в кислых почвах, как отмечает А. В. Петербургский, в почвенных раствор переходят соли алюминия и марганца, не благоприятно действующие на развитие корневой системы растений и процесс азотоусвоения, а также снижается содержание усвояемых форм фосфора, кальция, молибдена и углекислоты.

Важную роль во взаимоотношениях клубеньковых бактерий и бобовых растений играет температурный фактор. Максимальная азотфикация ряда бобовых растений наблюдается при 20-25оС. Температура выше 30оС отрицательно влияет на клубеньковые бактерии.

Соблюсти это условие позволило выращивание растения гороха на подоконнике, где нет резких колебаний температуры воздуха и почвы.

Следовательно, образование клубеньков – результат сложных явлений, начинающихся вне корня. Вслед за начальными фазами инфекции индуцируется образование клубенька, затем происходит распространение бактерий в зоне клубеньковой ткани и фиксация азота.

Сроки появления первых видимых клубеньков на корнях различных видов бобовых растений различны (М. В. Федоров,1952). Появление их у большинства бобовых культур чаще всего происходит во время развития первых настоящих листьев. Так, образование первых клубеньков люцерны посевной наблюдается между 4-м и 5-м днями после прорастания, а на 7-8 день этот процесс происходит у всех растений. Клубеньки у люцерны серповидной появляются через 10 дней.

Появление клубеньков у гороха Pisum Sativum произошло на 22 день после посева семян. Существенных различий в сроках появления клубеньков у сортов «Альпийский изумруд» и «Орегон» нами не обнаружено.

Клубеньки на корнях гороха имеют беловатую окраску, плотные на ощупь. В последствии окраска клубенька стала розоватой. Розовая окраска определяется наличием в клубеньках пигмента, по химическому составу близкого гемоглобину крови. В связи с этим пигмент называется леггемоглобином (легоглобином) – гемоглобином Leguminosae.

К моменту образования плодов (бобов) начался некроз клубеньков, они потемнели и стали более мягкими на ощупь. По литературным данным некроз у однолетних бобовых начинается в период массового цветения растения – хозяина. В нашем случае более позднее отмирание клубеньков связано с тем, что мы отмечали лишь видимые, заметные глазу процессы, когда они распространились уже из центра клубенька к его периферии. Старые клубеньки темные, дряблые, мягкие. При надрезе из них выступает водянистая слизь. Ученые считают, что процессу разрушения клубенька, начинающегося с опробковения клеток сосудистой системы, способствует понижение фотосинтетической активности растения, сухость, либо чрезмерная влажность среды (почвы и воздуха).

Заключение и выводы.

Проблема сохранения почвенного плодородия одна из важнейших, ведь от нее напрямую зависит обеспечение людей пищей.

Попытки решить ее путем внесения химических удобрений имеет и негативные последствия. Неудивительно, что в странах с высокоразвитым земледелием обычно до 20-25% окультуренной площади занято бобовыми растениями. При этом одновременно можно получить и ценный корм – зеленую массу растений и обогащение почвы азотом.

К сожалению, садоводы-любители в своей практике не используют такой простой и, что более важно, экологически чистый артотехнический прием, как посев сидератов – зеленых удобрений. Часто можно видеть, как сжигают или выносят за пределы участка растительные остатки. А ведь за период вегетации растения забирают из почвы азот для построения своего тела. Теряет почва азот и в результате уборки урожая. И вместо того, чтобы посадить горох, фасоль, клевер, люцерну, люпин, робинию, дачники вносят в обедненные почвы азотные удобрения, засоряя почву нитратами. Актуально, будто сегодня, а не в ХIХ веке написаны великим русским писателем-сатириком М. Е. Салтыковым-Щедриным строки: «Нынче химики да физики в ходу Такое уже нынче время настало, что в церкву не ходят, а больше, с позволения сказать, в удобрения веруют».

Поэтому важен еще и просветительский аспект работы, связанный с необходимостью выращивания растений семейства Бобовых.

Выводы.

1. Симбиотические клубеньки образовались на корнях у всех посаженных растений гороха Pisum sativum.

2. Видимые клубеньки на корнях гороха появляются через 22 дня после посева семян.

3. Заметных отличий в образовании клубеньков у сортов «Орегон» и «Альпийский изумруд» не выявлено.